Введение
Дефицит костной ткани встречается достаточно часто при травматолого-ортопедических операциях. Наиболее наглядно данная проблема прослеживается при эндопротезировании тазобедренного сустава. Так, после первичного эндопротезирования в результате нарушения процессов стрессового ремоделирования (stress shielding) вблизи имплантата формируется дефицит костной ткани. В свою очередь формирование дефицита костной ткани к 12-15 месяцу после операции становится причиной
развития ранней асептической нестабильности эндопротеза [1]. Данное обстоятельство приводит к необходимости проведения повторного ревизионного эндопротезирования во время которого хирурги сталкиваются с еще более выраженным дефицитом костной ткани в области оперативного вмешательства.
Для решения данной проблемы возможно использовать методы тканевой инженерии. Тканевая инженерия костной ткани использует матрицы различного состава и строения, способные воссоздать на своей основе натуральную костную ткань. Тканеинженерные матрицы имитируют состав и строение естественного внеклеточного матрикса кости, что создает благоприятные условия для адгезии, пролиферации и дифференцировки клеток остеогенного ряда. Взаимодействие матрицы и остеогенных клеток призвано формировать на своей основе естественную костную ткань. Данный подход подробно описан и признается перспективным на уровне мировой литературы [2]
Braghirolli 2014.
Для обеспечения способности тканеинженерных матриц создавать на своей основе костную ткань к ним выдвигается ряд требований, таких как остеогенность, ангиогенность, биоимитация, биосовместимость,
биодеградация, пористость и фильтруемость.
Для производства матриц, способных удовлетворить описанные требования используют[3]
Tereshchenko 2015:
Синтетические биодеградирующие полимеры – поликапролактон, полилактид,
полилактид-ко-гликолид для обеспечения свойств биосовместимости и
биодеградируемости.
Органические соединения естественного внеклеточного
матрикса кости – коллаген, желатин, хитозан для обеспечения свойств
биосовместимости и остеогенности.
Неорганические соединения естественного внеклеточного
матрикса – гидроксиаппатит и бета-трикальций фосфат для обеспечения
свойств биосовместимости и остеогенности.
Сигнальные молекулы – bone morphogenetic protein (BMP) и vascular endothelial growth factor (VEGF) для обеспечения остеогенности и
формирования сосудов соответственно.
Структура матрицы стремится повторить строение натуральной
костной ткани:
Наноразмеры волокон в матрице;
Микроразмеры пор в матрице.
Нано- и микроструктурированность матрицы может быть достигнута путём
производства на аппарате электроспиннинга[4]
Tereshchenko 2016 и необходима для обеспечения пористости и
фильтруемости матрицы, что обеспечит проникновение остеогенных и ангигенных
клеток из окружающих тканей и запустит процессы образования натуральной костной
ткани и интеграции покрытия с собственной костной тканью.
По мнению автора подобные матрицы можно применить как для профилактики возникновения дефицита костной ткани при первичном эндопротезировании тазобедренного сустава так и для возмещения дефицита костной ткани во время ревизионных операций. Направление данной работы поддержано грантом УМНИК фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере.
Материалы и методы
На базе Центра коллективного пользования научным оборудованием, организованном АО "ИМТЦ Медицинский технопарк", методом электроспиннинга (аппарат NF-103 MECCO, Япония) получен ряд матриц, отвечающих поставленным требованиям о составе и структуре:
тип композитная матрица из поликапролактона (PCL) и желатина (Gel) с наноразмерами волокон в конструкции.
тип композитная матрица из микроволокон PCL и нановолокон Gel.
тип композитная матрица из микроволокон PCL с добавлением бета-трикальций фосфата(TCP) в волокна.
тип композитная матрица из микроволокон PCL с добавления TCP и гидроксиаппатита(HA) в волокна.
Подготовка растворов для элеткроспиннинга
Для изготовления 1 типа матриц использовали раствор 12% (масса полимера к объему растворителя, тут и далее) PCL и Gel в трифторэтаноле(TFE). Для изготовления матриц 2 типа использовали 25% раствор PCL в хлороформе и 10% раствор желатина в TFE. Для изготовления 3 и 4 типов матриц 25% PCL растворяли в хлороформе и далее взвешивали в растворе 10%(от массы PCL) TCP для 3 типа и 10% TCP плюс 15% HA(от массы PCL) для 4 типа матриц. Растворы помещались в пластиковые шприцы объемом 3 и 5 мл для дальнейшего электроспиннинга.
Параметры электроспиннига
Параметры электроспиннинга были подобраны так, что бы при схожих параметрах, но из разных растворов могли быть получены нано- и микроволокна в матрицах. Для всех типов матриц вольтаж составлял kV=20 кВ, расстояние до приемного коллектора 15 см, иглы для нановолокон 27G для микро 18G. Для 1 типа матриц скорость подачи раствора составила 1 мл/ч, для 2 типа подача растворов осуществлялась из 2х шприцов одновременно со скоростью 0,8 мл/ч для 25% PCL и 0,5 мл/ч для 10% Gel. Для 3 и 4 типов раствор подавался из одного шприца со скоростью 0,8 мл/ч. Приемный коллектор покрывался алюминиевой фольгой. После электроспиннинга матрицы снимали и оставляли сушиться от остаточного растворителя при комнатных условиях.
Результаты
Визуализация структуры полученных матриц осуществлялась с помощью
микроскопии на аппарате Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия) для микроволокон и электронной
микроскопии на аппарате Mira3 (TESCAN, Чехия) для нановолокон. 1 тип матриц при снятии
с фольги проявлял липкие свойства и частично оставался на коллекторе, что можно
объяснить наличием большой фракции желатина в матрице. При визуализации
показана однородная структура матрицы, диаметр волокон варьировал в узком
диапазоне, обнаружено наличие небольшого количества капель раствора на матрице.
Средний диаметр волокон в матрице составил 236,34±54,13 нм, средний размер пор
5,99±2,14 мкм. В матрицах 2 типа были обнаружены нано- и микроволокна, что
соответствует методу производства из двух шприцов: 25% PCL сформировал микроволокна, 10% Gel сформировал
нановолокна. Структура матриц однородна, диаметр волокон для нано- и для
микрочасти варьировал незначительно. Средний размер волокон наночасти составил
192,87±39,45нм, микрочасти 4,21±1,19 мкм. Средний диаметр пор 23,08±8,69 мкм.
Матрицы 3 и 4 типов оказались разнородными по структуре. Диаметр волокон варьировал
в широком диапазоне. Наряду с закономерным для использованных растворов
наличием микроволокон в матрице, обнаружено парадоксальное появление
нановолокон. В некоторых волокнах отчетливо визуализировалось вкрапление
микрочастиц b-TCPи HA, что еще более увеличивало диаметр волокна.
Наличие в матрице неспрогнозированных нановолокон и волокон, увеличенных
частицами кальций фосфатов, сделало матрицы разнородными по структуре. Средний
диаметр волокон составил для 3 типа 13,97±10,83 мкм, 4 типа 12,85±11,7 мкм, пор
для 3 типа 55,4±27,1 мкм, 4 типа 44,37±21,39 мкм.
Заключение
Проведение данной работы подтвердило возможность
использования электроспиннинга для создания тканеинженерных матриц, имитирующих
естественный внеклеточный матрикс и обладающих различным составом и строением.
Были успешно использованы различные группы материалов, такие как синтетические
биодеградирующие полимеры - поликапролактон, натуральные полимеры - желатин,
неорганические соединения - кальций фосфаты (b-трикальций
фосфат и гидроксиаппатит). Показана возможность получения как микро- так и
нановолокон даже в одной конструкции. Матрицы из синтетических и натуральных
полимеров отличаются высокой однородностью размеров волокон и пор внутри
конструкции. Добавление взвеси кальций фосфатов в раствор для электроспиннинга
сделало матрицы разнородными в своей микроструктуре, так, обнаружено
неспрогнозированное формирование нановолокон и отложение крупных частиц кальций
фосфатов внутри волокон. Скорее всего такой результат объясним наличием крупных
в несколько микрометров частиц кальций фосфатов в смеси, ведь при использовании
наночастиц тех же материалов такого эффекта не наблюдалось[5]. При анализе
среднего диаметра волокон и размеров пор всех типов матриц, отмечена прямая
сильная корреляционная связь(r=0.98721) диаметра волокон и размеров пор. В связи
с данным наблюдением выгодно отличается 2 тип матриц, где удалось достигнуть
заявленных требований по формированию в матрице нановолокон и микропор, что
стало возможным благодаря электроспиннингу их двух шприцов, где один раствор
формировал микрочасть, а второй – нано. Такой прием призван увеличить
пористость матрицы и ее инфильтрацию клеточными элементами за счет микрочасти,
при сохранении адгезии, пролиферации и дифференцировки клеток, заданных
наночастью[6]
Kwak 2016.
Для определения возможности использования подобных
матриц для возмещения дефектов костной ткани необходимо дальнейшее исследование
их биосовместимых свойств в экспериментах in vitro и in vivo. Очевидно, потребуется дальнейшая модификация
состава и структуры матриц для обеспечения оптимальных свойств остео- и ангиогенности,
биоимитации, биодеградации, пористости и фильтруемости.
Список использованной литературы
Родионова С.С., Торгашин А.Н. Профилактика ранней асептической нестабильности эндопротезов крупных суставов. Клинический протокол. 2013.
Daikelly I. Braghirolli, Daniela Steffens, Patricia Pranke.
Electrospinning for regenerative medicine: a review of the main topics. Drug Discovery Today 19, 743–753 (2014).
V. P. Tereshchenko, I. A. Kirilova, M. A. Sadovoy, P. M. Larionov. The materials used in bone tissue engineering. (2015).
Valery Tereshchenko, Pyotr Larionov, Irina Kirilova, Mikhail Sadovoy, Ekaterina Mamonova. MATERIALS AND METHODS OF BONE TISSUE ENGINEERING. Hir. pozvonoč. 72–81 (2016). In Russian
Raghavendran HR Balaji, S Puvaneswary, S Talebian, MR Murali, SV Naveen,
G Krishnamurithy, R McKean, T Kamarul. A comparative study on in vitro
osteogenic priming potential of electron spun scaffold PLLA/HA/Col,
PLLA/HA, and PLLA/Col for tissue engineering application.. PLoS One 9, e104389 (2014).