Apéndice

Sistema experimental

Plásmidos

El plásmido pBGT es un plásmido previamente publicado en \cite{San_Millan_2016} el cual es un plásmido multicopia tipo ColE1 (replica mediante RNAI y RNAII) con ~19 copias por célula con una β-lacatamasa (TEM-1) la cual confiere resistencia a ampicilina, un gen reportero gfp bajo un promotor de arabinosa para inducir su expresión y el gen de resistencia a cloranfenicol utilizado para la selección durante la transformación.
El plásmido pBRT12, el cual se construyó a partir del plásmido pBGT-R164 \cite{San_Millan_2016} el cual tiene la variante de la β-lactamasa TEM-12 que confiere resistencia a ceftazidime y resistencia moderada a ampicilina, se intercambió el gen reportero gfp por el reportero dsRed y se inactivó  el gen de resistencia a cloranfenicol para la selección de dobles transformantes.

Cepas

Los anteriormente descritos plásmidos fueron insertados en la cepa E. coli MG1655, generando tres distintas cepas. Una que sólo porta el plásmido pBGT-1 (G1), otra que sólo porta el plásmido pBRT-12 (R12) y otra heterocigota que porta ambos plásmidos (HT).

Medios

El medio utilizados en todos los experimentos para observar crecimiento celular fue LB Broth (Miller).
En los microfluidos se utiliza M9 sin nutrientes para capturar las bacterias que salen de las trampas.

Determinación de número de copias por qPCR

Los procedimientos de extracción total de ADN pueden introducir un sesgo en la relación entre plásmido y cromosoma [020]. Una alternativa y un procedimiento más sencillo que da buenos resultados es el uso directo de cultivos hervidos \cite{Skulj_2008}⁠. Sin embargo, se encontró que las sales presentes en los medios de crecimiento pueden interferir con la qPCR. Para evitar esta interferencia, alícuotas de 100μl (este volumen puede ampliarse o hacia abajo) se centrifugaron (60 '' a 16.000 g), el sobrenadante se retiró y el pellet se resuspendió en un volumen igual de miliQH2O2. Entonces, las muestras fueron hervidas a 95ºC durante 10 min utilizando un termociclador (pero un baño de agua o un termobloque puede también se utiliza) y posteriormente congelado a -20ºC. Las muestras se pueden almacenar en esta etapa por largos tiempos. Antes del uso, las muestras se descongelaron a temperatura ambiente y centrifugadas (30 segundos a 16.000 g) para precipitar desechos celulares. Diluciones apropiadas del sobrenadante se usaron como molde para las reacciones qPCR.
Desarrollamos una reacción qPCR específica para pBGT (pBGT-F: ACATTTCCGTGTCGCCCTT, pBGT-R: CACTCGTGCACCCAACTGA, tamaño del amplicón: 115 pb, eficacia: 94,29%, R2 = 0,99) y se utilizó una anteriormente descrita qPCR para el gen cromosomal monocopia dxs (dxs - F: CGAGAAACTGGCGATCCTTA, dxs - R: CTTCATCAAGCGGTTTCACA, amplicón tamaño: 113 pb, eficiencia: 95,52%, R2 = 0,99) [022] para comparar la relación de plásmido y ADN cromosómico.
También se utilizaron primers para  GFP (GFP-F: CCTGTCCTTTTACCAGACAACC, GFP-R: TCCCAGCAGCTGTTACAAAC; tamaño del amplicón 112bp, eficiencia: 97,79%, R2 = 0,99) y dsRED (RFP-F: GTTCCAGTACGGCTCCAAG, RFP-R: CCGTCCTCGAAGTTCATCAC; amplicón tamaño: 114 pb, eficiencia: 94,81%, R²= 0,99) para determinar del número de copias del plásmido. Eficiencia de la se calculó a partir de la curva estándar generada por la realización de qPCR con cuatro diluciones de 8 veces de ADN molde en triplicado (~ 5 ng / μl a 12 pg / μl de trabajo gama de concentración de ADN). qPCRs se realizaron utilizando ABI SYBR Select Master Mix (Life Technologies, EE.UU.) a una concentración final de ADN de 0.1 ng / μl (1 μl de ADN muestra por reacción) y siguiendo las instrucciones del fabricante. La amplificación las condiciones fueron: desnaturalización inicial durante 2 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de desnaturalización durante 15 s a 95 ° C, recocido y extensión durante 1 min a 60 ° C. Después de la la amplificación fue completa y para controlar la especificidad de la reacción, el análisis de la curva se realizó enfriando la reacción a 60 ° C y luego calentando
lentamente hasta 95 ° C. Se utilizaron muestras de calibración Inter-run para normalizar los resultados de diferentes placas de cada qPCR. El número de copias se calculó utilizando el método ΔΔCT como se ha descrito anteriormente, dado que las eficiencias de amplificación de las distintas reacciones fueron aproximadamente iguales \cite{Lee_2006}.

Experimentos en poblaciones

Experimentos evolutivos

Los experimentos evolutivos consisten en realizar diluciones seriales de poblaciones de bacterias creciendo en un medio de cultivo específico. Las diluciones seriales consisten en tomar un porcentaje de un cultivo (usualmente 1%) y usar este para inocular otro medio, típicamente se hace una dilución cada 24 horas.

Rampas de antibióticos

Nombramos rampas de antibióticos a un experimento evolutivo en el cual las bacterias crecen en medio de cultivo con determinada concentración de antibióticos y a al día siguiente se aumenta la concentración del antibiótico.

Experimento de invasión

El experimento de invasión es una rampa de antibióticos, en este caso Caz. El primer día iniciamos con un cocultivo de una población de 99% de G1 (susceptible a Caz) y 1% de R12 o 1% de HT (resistentes a Caz). La concentración inicial de Caz fue ⅛ de la CMI para G1 y cada día de duplica la concentración de Caz.

Arreglo de antibióticos.

Cada arreglo consiste en media placa de 96 pozos, en la cual se utilizó la técnica de checkerboards [53]. De izquierda a derecha se utilizaron las siguentes concentracioes de Ampicilina (0,1,2,4,8,16) mg/ml, siendo  8 mg/ml la CMI para la cepa G1 (resistente a Amp). De abajo a arriba se utilizó (0,1,3,4,8,16,32,64)  \(\mu\) g/ml siendo 32  \(\mu\) g/ml la CMi para la cepa R12 (resistente a Caz). Así el pozo de abajo izquierda no contiene antibiótico y el pozo de arriba derecha tiene la máxima concentración de antibiótico 64   \(\mu\) g/ml de Caz y 16 mg/ml de Amp.

Experimentos en células individuales

Sistema de Microfluídica

Nuestro sistema de microfluidos consta de tres partes acopladas:
1. El dispositivo de microfluidos 
Es chip de PDMS que cuenta con dos entradas para medios de cultivo, una entrada para las células; una serie de 48 trampas de bacterias, cada una de estas trampas son de un tamaño de 30x40x1  \(\mu\) m lo que nos permite observar una monocapa de aproximadamente 500 bacterias; y varias salidas en las cuales se desechan células que escapan de las trampas y el medio utilizado en turno. El diseño del chip está publicado en [030] y podemos ver su arquitectura en (S Fig \ref{933018})
2. El sistema Dial-A-Wave (DAW) 
Es una serie de motores mecánicos controlados por computadora que mueven las alturas de los medios cultivo y de los medios de captura de desechos. Con esto podemos controlar dinámicamente cuál de los dos medios de cultivo entra al chip y en qué proporciones así como la velocidad del flujo.  Los motores son controlados mediante tarjetas Stepper Phidget y estas son controladas por un software libre que nos permite controlar dinámicamente los motores. 
3. El sistema de microscopía
Contamos con un microscopio de epifluorescencia (Nikon eclipse Ti-E) el cual cuenta con una platina motorizada controlada por computadora que nos permite tomar fotos del dispositivo de microfluídica en distintas posiciones y distintos lapsos de tiempo, con esto podemos obtener una serie de tiempo de cada una de las trampas y así observar la respuesta de las bacterias ante los cambios de medio, en este caso los antibióticos. El microscopio cuenta también con una incubadora integrada lo cual nos permite controlar la temperatura en la que crecen las bacterias.

Procesamiento de imágenes

Desarrollamos  \(\mu\)J una serie de scripts/programas en diversos lenguajes de programación que consiste en:
1) Ordenar por canales y tiempo los archivos obtenidos por el software del microscopio (Nikon Elements).
2) Alinear cada una de las trampas durante la serie de tiempo puesto que existen pequeñas variaciones cuando el microscopio regresa a cierta posición.
3) Realizar diversos procesamientos a las imágenes para generar una imagen segmentable, esto es, identificar los objetos en la imagen, en estos experimentos se decidió utilizar las fotos de fluorescencia de DsRed y GFP, primero realizamos una deconvolución utilizando una función de dispersión puntual teórica utilizando parámetros reales de la óptica microscopio, con esto producimos una imagen más nítida, seguido de esto realizamos un aumento de contraste normalizando y ecualizando el histograma de intensidad de grises de cada imagen, después invertimos la escala de grises puesto que el programa utilizado para segmentar identifica objetos oscuros en un fondo claro y al final conjuntamos ambos canales de fluorescencia mediante la operación “minimo”, esto es, creamos una nueva imagen (DsRed+GFP) donde en cada pixel se toma el mínimo en intensidad de las dos imágenes de fluorescencia.
4) Preparamos la estructura de carpetas y nombres para poder utilizar el programa de segmentación .
5) Realizamos la segmentación utilizando DeepCell \cite{Van_Valen_2016}, un programa que utiliza convolución de redes neuronales para generar unas nuevas imágenes binarias llamadas máscaras donde solo se encuentran los objetos identificados, este programa requiere de un alto nivel de procesamiento por lo que utiliza CUDA un lenguaje que permite utilizar una tarjeta gráfica como un cluster de procesadores.
6) Procesamos las máscaras para generar unas nuevas que sólo contengan las células que se encuentran dentro de las trampas.
7) Hacemos una corrección manual de las máscaras sobreponiéndolas con las imágenes segmentables.
8) Utilizando las regiones correspondientes a cada célula tomamos las intensidades de fluorescencia de las imágenes originales para producir tablas de datos.
9) Utilizamos estas tablas para producir diversas gráficas donde se muestre el cambio en las proporciones entre las fluorescencias.

Modelo de agentes individuales

Este es un modelo mecanístico con el cual simulamos bacterias como un objeto computacional. Estas bacterias cuentan con distintas propiedades como un identificador, nivel de energía, parámetros metabólicos, y tres genotipos, contamos con el silvestre, una que porta el gen de resistencia  en cromosoma y una que porta el gen de resistencia en un plásmido multicopia.
El número de copias asociado a cada bacteria se obtiene a partir de una distribución normal con media μ, esta media está asociada a cada bacteria; y cierta desviación estándar \(\sigma\), asociada a la población en general. Las bacterias cuentan con dos tipos de plásmidos, A y B, asociados a portar los genes de resistencia a Amp  y Caz respectivamente.
Tomamos en cuenta mutaciones al azar en el gen resistencia εP y mutaciones en mecanismo de control de número de copias εC, cayas  probabilidades están ajustadas las densidades de poblaciones alcanzadas por una simulación ~4x104. Consideramos que cada mutación en el gen de resistencia convierte el plásmido A en el plásmido B y recíprocamente. Consideramos también que cada mutación en el mecanismo de control de número de copias duplica el promedio de número de copias.
Para modelar el crecimiento poblacional, consideramos un recurso limitante ambiental R y cada bacteria incorpora recursos considerando parámetros metabólicos individuales. La incorporación de recursos sigue una dinámica tipo Michaelis-Menten mediante una función de crecimiento  G(R)= c * u(R)  donde c representa la eficiencia de conversión de recursos y está asociada al número de copias de cada bacteria, y u(R) es la función de incorporación de recurso general y tiene la forma u(R)=(Vmax*R)/(Km+R) con Vmax representando la máxima tasa de incorporación y Km la constante de saturación media.
Para tomar en cuenta la acción de los antibióticos, consideramos los perfiles de resistencia obtenidos experimentalmente para las cepas homocigotas de plásmidos, es decir, las que cuentan con sólo la variante TEM1 (G1) y sólo la variante TEM12 (R12) de la b-lactamasa; así como también los perfiles de resistencia de las cepas que portan el gen de resistencia en cromosoma y para la cepa silvestre. Con esta información asociamos el número de copias de cada gen a su nivel de resistencia mediante una regresión lineal. Así, calculamos el perfil de susceptibilidad/resistencia considerando el número de plásmidos de cada tipo que cada bacteria porta.
Con estos supuestos, una realización del modelo consiste en la siguiente mecanística: las bacterias incorporan recursos hasta que alcanzan un nivel de energía crítico (cATP), cuando éste es alcanzado entran en un proceso de división el cual consiste en dividir su energía inequitativamente entre la célula madre y la hija, repartir los plásmidos entre la célula madre y la hija, tomando en cuenta que cada plásmido se segrega al azar con una probabilidad de 0.5; después entrar en un proceso de replicación de plásmidos donde para cada una de las bacterias, se calcula el número final de plásmidos obteniendo un número al azar de una distribución Normal(μ,  \(\sigma\) ), la proporción final de plásmidos depende de la proporción inicial, aquí consideramos también mutaciones en el gen de resistencia por plásmido y que las mutaciones que caen en el mecanismo de control de número de copias afectan al número de copias total respetando las proporciones iniciales.
Como los antibióticos considerados son b-lactámicos, consideramos que estos tendrían más efecto en bacterias que crecen con una mayor velocidad. Para ello establecimos otro umbral (maxgATP) el cual se efectúa con un nivel de ruido. Entonces consideramos la concentración de antibióticos en el ambiente y el perfil de resistencia descrito anteriormente para decidir si la bacteria sobrevive o muere, también con otro nivel de ruido. Consideramos también que las bacterias tienen la capacidad de degradar el antibiótico a nivel intracelular y mediante esta degradación reducir la concentración de los antibióticos en el ambiente.
Iteramos este proceso para cada bacteria en la población en cada momento del tiempo. Usualmente cada realización consta de 24 horas y con esto somos capaces de realizar experimentos evolutivos donde cada día tomamos una muestra de la de la realización anterior y la sometemos a una nueva concentración de antibióticos. Así mismo producimos una versión que llamamos quimiostato donde las realizaciones se realizan con tiempos no múltiplos de 24 horas y ponemos un límite máximo de la población para cada momento, usualmente 1000 bacterias, si la población excede este límite, descartamos al azar un número apropiado de bacterias.

Modelo de dinámica de poblaciones

El objetivo del modelo es estudiar poblaciones en respuesta a diferentes condiciones ambientales, (recurso limitante y antibióticos). Por ello se considera que la población está compuesta de una subpoblación libre de plásmidos con densidad al tiempo t denotada por Bpf(t), una subpoblación heterocigota con densidad BHT(t) y subpoblaciones homocigotas G1 y R12 representadas por BG1(t) and BR12(t) respectively.
Se considera que el crecimiento de cada población depende de la concentración del recurso limitante ambiental R(t), por ello podemos modelar el crecimiento de una subpoblación i comp
Gi(R) = ρiUi(R), donde ρi es un parámetro constante y  Ui(R) = VimaxR/(Kim+R) una función de incorporación de recursos con parámetros Vimax y Kim  que denotan respectivamente la máxima tasa de crecimiento y la constante de saturación de la subpoblación i. Para tomar en cuanta la acción de los antibióticos (Amp y Caz) representados por DAMP y DCAZ respectivamente, consideramos el perfil de susceptibilidad de la cepa Bi  a Amp y Caz por un término lineal con un parámetro de inhibición κiAMP y κiCAZ respectivamente. También δiAMP y δiCAZ denota tasa de inactivación de DAMP y DCAZ respectivamente para la cepa Bi .
Como los estos plásmidos se segregan al azar, la probabilidad de que una célula que porta plásmidos produzca una libre de plásmidos es un proceso de Poisson que depende del promedio de número de plásmidos, esto es Σ = 21−μ donde μ denota el promedio de número de plásmidos en la población \cite{Millan_2014}.
De igual manera, la probabilidad de que una célula heterocigota produzca una homocigota, asumiendo que HT tiene la misma proporción de plásmidos, puede ser estimada por σ = 21−μ/2 . En nuestro sistema experimental el promedio de número de copias del plásmido es 19 y por ello la tasa de pérdida de heterocigosis es 1/362 mientras que la tasa de pérdida de plásmidos es considerablemente menor, 1/524,288.
Finalmente dinámica evolutiva del sistema considera que la transición de BG1 y BR12 a BHT ocurre en una tasa ε > 0, representando la tasa de mutación puntual en los alelos blaTEM-1 o blaTEM-12.
En resumen, el sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias que describe la dinámica de plásmidos a nivel de poblaciones, puede escribirse de la siguiente manera: