Introducción
La identificación y cuantificación de ácidos orgánicos en diferentes frutas es importante para la evaluación tecnológica y de calidad de bebidas y alimentos. Los ácidos orgánicos son un índice útil de autenticidad en productos con base en fruta, debido a que tienen baja suceptibilidad a cambiar durante el procesamiento y almacenamiento, más que otros componentes de las frutas, por lo que muchos, entre ellos el ácido cítrico, son utilizados como aditivos en bebidas para realzar el sabor y aumentar la estabilidad de estas. El conocimiento de los niveles de ácidos orgánicos puede ser útil para la determinación del porcentaje de jugo y también para detectar adulteraciones en éste. La composición de los ácidos orgánicos en frutas es también de interés debidos a su impacto en las propiedades sensoriales. A pesar de que son componentes minoritarios, combinados con azúcares, son importantes atributos de la calidad sensorial de frutas crudas y procesadas.
Las frutas cítricas son clasificadas como frutas ácidas, debido a que su contenido de compuestos sobre todo de ácidos orgánicos y azúcares, que son utilizados como el principal índice de madurez y una de las mayores medidas analíticas de calidad de sabor. Los ácidos más abundates en las frutas cítricas son los ácidos cítrico, ascórbico, y málico, con cantidades traza de tartárico, benzoico, oxálico y succínico. En el limón, el contenido de ácido cítrico se ha encontrado desde 6.88 g/L hasta 73.93 g/L, y el de ácido ascóbico en un rango de 0.215-0.718 g/L.
Métodos analíticos que involucran reacciones colorimétricas han sido utilizados para el estudio del ácido cítrico: espectrofotométricos y ensayos enzimáticos. Sin embargo, las técnicas cromatográficas permiten el análisis simultáneo de la mayoría de los componentes del zumo obtenido del limón. La mayoría de los procedimientos desarrollados hasta ahora para el análisis de bebidas y alimentos utilizan cromatografía de partición en fase reversa, basándose principalmente en la diferencia de solubilidades de los componentes de la muestra en la fase móvil o estacionaria; o cromatografía iónica (de intercambio aniónico), fundamentada en la separación por la diferente afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra, con detectores de índice de refracción (RI), espectrofotometría UV, conductimetría o detección electroquímica.
La coulombimetría
En el presente estudio se determinó el contenido de ácido cítrico para el zumo de limón obtenido de la fruta por medio de una extracción simple, empleando HPLC con detección UV y la acidez total de este por coulombimetría.
Materiales y métodos
El zumo a estudiar fue extraído un limón fresco (Citrus limon) comercial comprado en un supermercado local (67.2611 g ± 0.0001 g). La fruta saludable fue seleccionada aleatoriamente por uniformidad de forma y color.
HPLC
Preparación de la muestra
El limón empleado para la muestra fue cortado y la parte correspondiente fue exprimida para el análisis cromatográfico (23.8269 g ± 0.0001 g). Para alcanzar una solución uniforme, sin pulpa de fruta, se centrifugó el zumo a 4000xg por 10 min a temperatura ambiente. Se recolectó el sobrenadante obteniendo un volumen final de 2.5 mL ± 0.09 mL. Este volumen se llevó a un balón de 25 mL ± 0.03 mL con la fase móvil, en una dilución 1:10. Antes de la inyección en el equipo, la muestra se filtró por una membrana (0.45 µm). Se realizó un duplicado del análisis.
Equipo
Para la cuantificación del ácido cítrico en zumo de limón se empleó un sistema High Performance Liquid Chromatography Primaide Hitachi® , con detector UV (lámpara de Hg) a λ = 214 nm (a esta longitud de onda también fue posible observar el ácido benzoico presente en el zumo). La columna RP-HPLC Phenomenex - Kinetex® 2.6 µm C18 100 Å, 100 x 4.6 mm fue utilizada para el ensayo.
Preparación de la fase móvil
Primer día
Se prepararon dos soluciones buffer fosfato 20 mM a utilizar como fase móvil el primer día de la experiencia:
- Se disolvieron 0.7196 g ± 0.0001 g, de KH2PO4 y se llevaron a 250 mL ± 0.30 mL con agua desionizada. El pH del buffer se ajustó entonces a 2.50 añadiendo ácido fosfórico concentrado gota a gota, controlando con un pH metro calibrado. Concentración: 21.15mM ± 0.03 mM.
- Se disolvieron 0.7135 g ± 0.0001 g, de KH2PO4 y se llevaron a 250 mL ± 0.30 mL con agua desionizada. El pH del buffer se ajustó a 2.46 añadiendo ácido fosfórico concentrado gota a gota, controlando con un pH metro calibrado. Concentración: 21.81 mM ± 0.03 mM.
Estas dos soluciones se mezclaron para equilibrar la columna cromatográfica y realizar el posterior análisis.
Las soluciones estándar preparadas se llevaron a volumen con una tercera solución buffer preparada:
- Se disolvieron 0.2795 g ± 0.0001 g, de KH2PO4 y se llevaron a 100.00 mL ± 0.20 mL con agua desionizada. El pH del buffer se ajustó entonces a 2.44 añadiendo ácido fosfórico concentrado gota a gota, controlando con un pH metro calibrado. Concentración: 20.54 mM ± 0.04 mM.
Segundo día (una semana después)
La reproducibilidad y condiciones óptimas del método se pudieron evaluar al realizar un segundo ensayo la semana posterior al primero, el que se incluyó una nueva solución estándar de 5213.52 mg/L ± 81.15 mg/L, preparada el primer día.
Una nueva fase móvil se preparó de la siguiente manera: Se disolvieron 0.2786 g ± 0.0001 g, de KH2PO4 y se llevaron a 100 mL ± 0.20 mL con agua desionizada. El pH del buffer se ajustó entonces a 2.42 añadiendo ácido fosfórico concentrado gota a gota, controlando con un pH metro calibrado. Concentración: 20.47mM ± 0.04 mM.
Soluciones estándar
Se preparó una solución stock de 40104.00 ± 128.40 mg/L, pesando 1.0036 g ± 0.0001 g de ácido cítrico llevados a 25.00 mL ± 0.08 mL con la fase móvil. A partir de esta solución se obtuvieron los patrones a utilizar en la curva de calibración por dilución del volumen correspondiente en balones aforados de 5.00 mL ± 0.02 mL: 4411.44 ± 49.57 mg/L, 4812.48 ± 74.90 mg/L, 5614.56 ± 106.25 mg/L, 6015.60 ± 131.00 mg/L, 6416.64 ± 155.89 mg/L, 6817.68 ± 181.18 mg/L, y 7218.72 ± 191.84 mg/L. Para la determinación de la incertidumbre absoluta de las soluciones se tuvo en cuenta la calibración de la micropipeta BOECO 100-1000 uL utilizada para realizar las diluciones, en el Anexo 1.
Parámetros cromatográficos