Resumen
La malaria, también conocida como paludismo, es una enfermedad que ha acompañado a la humanidad por siglos y que afecta millones de personas alrededor del mundo. Actualmente, existen diversos esfuerzos para aliviar y eliminar dicha enfermedad, a pesar de los cuales aún no ha sido posible erradicarla. En Guatemala, existen regiones focalizadas donde hay transmisión de malaria. El uso de mosquiteros con insecticidas y el rociamiento con insecticidas ha sido parcialmente efectivo, pero diversos factores sociales y antropológicos, así como la aparición de resistencia a insecticidas, hacen necesaria la aplicación de nuevos métodos para poder lograr la eliminación de los focos de malaria en el país. La técnica de insecto estéril (SIT por sus siglas en inglés) es un método desarrollado en las últimas décadas, para el control de insectos en agricultura y cuya aplicación a insectos de relevancia a la salud pública se encuentra en auge. La técnica se basa en la producción e irradiación de cantidades masivas de machos. La irradiación induce esterilidad en los insectos tratados y estos son liberados en el campo, en donde copulan con hembras silvestres, reduciendo la población del insecto. En los mosquitos, la tecnología ha sido menos eficiente que en otros insectos debido a que las dosis de radiación requeridas inducir esterilidad en machos afecta el estado físico (competencia) de los mismos. Por ello, se propone desarrollar un método de esterilización basado en interferencia de ARN (iARN). Con este método, nuestro grupo de investigación propone alimentar larvas con ARN de doble hebra, específico para genes de espermatogénesis, para producir mosquitos estériles. El propósito del presente estudio fue investigar el perfil de expresión de dos genes previamente descritos en otras especies de mosquitos como genes de espermatogénesis, bol y zpg, en todas las etapas de desarrollo de Anopheles albimanus. Esto servirá como base para desarrollar protocolos eficientes para generar mosquitos estériles por medio de interferencia de ARN. Los perfiles de expresión se generaron mediante PCR en tiempo real de ADN complementario sintetizado de ARN mensajero extraído específicamente de 30 mg de tejido de An. albimanus de cada estadio de su ciclo de vida. Del análisis de la expresión relativa de los genes homólogos de boll y zpg con respecto a actina se obtuvo que boll tiene un patrón de expresión similar en todos los estadios igual que la expresión obtenida de zpg en larvas y pupas de An. albimanus. Sorprendentemente, se encontró que zpg se expresaba 70 veces más en adulto hembra que en macho, lo que indica que tiene funciones distintas en hembras que necesitan ser investigadas para saber el rol fisiológico. Se recomienda en estudios posteriores realizar disección de tejidos específicos del mosquito (Testiculos y ovarios) y evaluar de la misma manera la expresión de estos genes. Se puede concluir que el gen que tiene un mejor perfil para ser candidato a silenciar es zpg, porque se observará notoriamente la disminución de este cuando se silencie mediante interferencia de ARN.
Introduction
Mosquitoes transmit devastating infectious diseases. Malaria by P. vivax is a vector-borne disease that represents the 64% of cases in the Americas region, 34% in the South-East Asia Region, 42% and 23% in the in the Eastern Mediterranean and Western Pacific Region. In Guatemala large scale control campaigns have been attempted but despite the application of different vector control methods such as Insecticide treated nets and Indoor residual spraying, these methods have become limited (WHO, 2017). Currently, there are still focalized areas where malaria is still a health problem. From 2016 to 2017, it was reported a total of 6,867 cases of malaria and the rural areas with the highest incidence of malaria by P. vivax were: Escuintla, Izabal, Retalhuleu, Suchitepéquez and Alta Verapaz (SIGSA, 2017).
Considering these data and due to traditional methods of spraying are susceptible to the emergence of insecticide resistance as it was reported by Brogdon et al (1999), Dong (2007) and Dzul et al (2007); it is necessary the development of another sustainable control method such as the Sterile Insect Technique (SIT).
Practically speaking, this technique consists in the production of sterile population of insect’s pests with non-viable gametes and zygotes. Since the middle of the last century, the SIT was developed to control insects such as the fly Tsé-Tsé (Vreysen et al 2000); the Mediterranean fly, (Shelly et al 1994) and the apple moth (Bloem & Bloem, 1998). Although, irradiation or chemical agents can also be used to produce sterile insects, it was described by Dyck et al (2005) that it affects the physical condition and reproductive competence of wild insects.
Lofgren et al (1974) evaluate the use of An. albimanus chemosterilized in a lacustrine area, showing its effectiveness and that it is feasible to reduce mosquito populations with SIT. Recently, Zhang et al (2010) demonstrate the efficacy of RNA interference by suppressing the chitin synthase genes in An. gambie and Whyard et al (2015) showed that the silencing by RNA interference of the boll and zero population growth (zpg) genes produced sterile Ae. aegypti mosquitoes.
In Drosophila the Zero population growth gene (zpg) encodes a germline-specific gap junction protein, innexin 4, required for the survival of differentiating early germ cells during gametogenesis in both sexes. Flies with zpg null mutations are sterile and had tiny gonads (Tazuke et al. 2002). In Anopheles gambiae and Aedes aegypti, silencing zpg orthologs (AGP006241 and AAEL006726) via RNAi also produced sterile males, confirming that plays an important role during male gametogenesis (Thailayil et al. 2011) (Whyard et al. 2015). In Drosophila melanogaster and in Caenorhabditis elegans a mutation in the boll gene produce a meiotic arrest in the spermatogenesis of the fly (Eberhart et al 1996) and oogenesis of the nematode (Karashima et al 1999). Whyard et al (2015) identified by SSH this gene particularly in the testis of male Ae. aegypti.
In this study we proposed that sterilization of An. albimanus mosquitoes could be generated by silencing vital genes for spermatogenesis process and that SIT techniques in countries as Guatemala are sustainable and achievable. Therefore, the purpose of the following study is to investigate the expression profile of boll and zpg homologous genes at all stages of life cycle of An. albimanus. This will allow the development of efficient protocols to generate sterile mosquitoes produced by RNA interference and to compare their expression profiles.