Actualmente, la malaria causada por P. vivax provoca un estimado de casos a nivel mundial del 34%, 42%, 23% y 0.3% en las regiones de Sureste asiático, del Mediterráneo, del Pacífico occidental y en la Región Africana, respectivamente mientras que en América presenta el 64% de los casos de malaria mundiales causados por este parásito (WHO, 2017). En Guatemala, se está trabajando para eliminar esta enfermedad transmitida por mosquitos Anofelinos infectados con P. vivax. A pesar de la aplicación de distintos métodos de control vectorial, como la distribución de pabellones tratados con insecticida y debido a que las áreas que se rocían con insecticida son limitadas (WHO et al 2017); aún existen áreas focalizadas en donde la malaria sigue siendo un problema de salud (SISGSA, 2017). En el año 2016 y 2017, las áreas con mayor incidencia de malaria en Guatemala son: Escuintla, Izabal, Retalhuleu, Suchitepéquez y Alta Verapaz, en donde hubo un total de 6,867 casos confirmados de malaria por P. vivax (SIGSA, 2017). Debido que los métodos tradicionales de rociamiento son susceptibles a la aparición de resistencia a insecticidas (Brogdon et al 1999; Dong, 2007 y Dzul et al 2007), es necesario desarrollar otros métodos de control sustentables para alcanzar el objetivo de eliminación de malaria, como la técnica del insecto estéril (SIT por sus siglas en ingles).Esta técnica se ha desarrollado para el control de insectos plaga desde mediados del siglo pasado como la mosca Tsé-Tsé, (Vreysen et al 2000); la mosca mediterránea, (Shelly et al 1994); y la polilla de la manzana (Bloem & Bloem, 1998) y consiste en producir una población estéril de mosquitos que no producen gametos y cigotos viables. Esto también se puede llevar a cabo mediante radiación o agentes químicos, pero afecta el estado físico y la competencia reproductiva de los mosquitos silvestres (Dyck et al 2005). Es importante mencionar que en los 1970´s, se evaluó el uso de An. albimanus quimioesterilizados en El Salvador, mostrando su efectividad en un área lacustre (Lofgren et al 1974). Este estudio demostró que es factible la reducción de poblaciones de mosquitos con esta técnica. Recientemente, Zhang et al (2010) demostró la eficiencia de la técnica de interferencia de ARN por la vía oral al reprimir genes de quitina sintasa en An. gambie. En Aedes aegypti, Whyard et al (2015) mostró que el silenciamiento de los genes boll y zero population growth (zpg) usando esta técnica producía mosquitos estériles. Se propone que mosquitos An. albimanus estériles podrían ser generados mediante el silenciamiento de genes vitales para la espermatogénesis. Por lo tanto, el propósito del siguiente estudio es investigar el perfil de expresión de los genes homólogos de bol y zpg en todas las etapas de desarrollo de Anopheles albimanus. Esto permitirá desarrollar protocolos eficientes para generar mosquitos estériles por medio de interferencia de ARN (iARN) y comparar sus perfiles de expresión.
Methods
Mosquitoes
We used larvae, pupae and adults of Anopheles albimanus laboratory strain Sanarate maintained at x°C and x% relative humidity in the insectary of Centro de Estudios en Salud of Universidad del Valle de Guatemala, Guatemala
RNA extraction and cDNA production
RNA was extracted using a the SVTotal RNA isolation system (Promega) from 30mg of tissue of each stage of Anopheles albimanus, this is equal to 120 L1, 40 larvae L2, 30 larvae L3, 7 larvae L4, 5 pupae, 15 female adults and 25 male adults. RNA quantity and purity was measured with Nanodrop One (Thermofisher). One microgram of Dnase I (Promega) treated RNA was used to generate the first strand of cDNA using the kit GoScript Reverse Transcription System with Random primers and Oligo(dT)15 Primer according to the manufacturer instructions.
Gene expression analysis
The mRNA expression levels for each stage was measured by qPCR with Power Up Sybr Green(Thermo Scientific, ) in a LightCycler 96 (Roche). The following primers and concentrations were used: boule, (XuM),5’ 3’; zpg, (XuM),5’ 3’ and actin, (XuM),5’ 3’. The conditions of the RT-qPCR were as follow: XXX. To monitor primer specificity, melting curves were performed. Reaction were performed in triplicates using XuL cDNA diluted 1:10 in a total volume of 15uL per reaction. We used the Δ ΔCt method to evaluate the gene expression using the actin gene (cita) as a reference gene.
Statistical analysis