Resumen
Los estudios de biomonitoreo mediante ADN ambiental utilizan
herramientas de caracterización genética (metabarcoding) para describir
la composición de la comunidad. Estos estudios contrastan las secuencias
obtenidas con bases de datos genómicas públicas para así identificar la
especie. Sin embargo, las bases de datos mitocondriales de referencia
distan mucho de estar completas. En la mayor parte de los casos solo hay
unos pocos genes disponibles o los datos existentes no ofrecen
resolución hasta el nivel de especie. En este estudio presentamos un
método dedicado a generar mitogenomas de peces completos de forma
rentable y sin necesidad de amplificación del ADN, con el objeto de
ampliar las bases de datos mitocondriales de peces. Para ello se
utilizaron dos enfoques diferentes de secuenciación de fragmentos largos
utilizando secuenciación Oxford Nanopore y enriquecimiento de ADN
mitocondrial. Uno en el que el enriquecimiento se logra mediante el
aislamiento preferencial de mitocondrias seguido de extracción del ADN y
la eliminación del ADN nuclear (”mitoenriquecimiento”). En el segundo
enfoque se aprovecha la capacidad de escisión dirigida por la
endonucleasa CRISPR-Cas9 sobre ADN previamente desfosforilado
(”mitosecuenciación dirigida”). Los resultados difirieron con el tejido,
la especie y la integridad del ADN. El método de mitoenriquecimiento
produjo un 0,17-12,33% de secuencias objetivo y una cobertura media
entre 74,9 y 805 secuencias. El experimento de mitosecuenciación
dirigida a partir de ADN genómico nativo produjo entre 1,83 y 55 % de
secuencias objetivo y una cobertura media de 38 a 2123 secuencias. Este
estudio permitió completar mitogenomas de diferentes especies que
incluyen regiones homopoliméricas, repeticiones en tándem y
reorganización de genes. Demostramos que la secuenciación intensiva de
fragmentos largos de ADN de peces es posible, se puede lograr con bajos
recursos informáticos de una manera económca, superando el método
generalizado de secuenciación genómica de baja cobertura y permitiendo
el descubrimiento de mitogenomas de taxones de peces no modelo o poco
estudiados a una amplia gama de laboratorios en todo el mundo.
Keywords: mitogenome, fish, eDNA, long fragment, Cas9 targeted
sequencing, mitochondrial enrichment